大包装蛋白原料 dCas9酶，基于定位功能的分子诊断检测方法

paired dCas9(PC)使用一对dCas9蛋白，分别融合荧光素酶的两个分离结构域（NFluc和CFluc），并通过两个靶向相邻序列的gRNA实现检测。其反应原理如图3所示：当存在靶标DNA时，两个分别带有荧光素酶结构域的dCas9，在gRNA的引导下结合到相邻的靶标序列上，荧光素酶的两个分离结构域相互靠近，形成有活性的荧光素酶，在ATP和氧气存在条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，并产生可检测的荧光信号。

PC技术dcas9.jpg

②RCH技术

RCA-CRISPR-split-HRP(RCH)结合了滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)、CRISPR/dCas9和辣根过氧化物酶(HRP)技术，可经显色反应区分miRNA的单碱基差异。其反应原理如图4所示：首先，靶标miRNA与哑铃状特异性探针结合，打开探针的双链茎部区域，形成环状探针，并在phi29 DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，形成很多重复连续的单链DNA序列，且由于序列本身存在互补配对区域，可经互补配对形成大量规则的茎-环结构；然后，加入融合了split-HRP报告片段的dCas蛋白，并在sgRNA 的引导下，定位至扩增产物的茎-环结构，分离的HRP报告片段因此聚集，形成有活性的HRP蛋白；HRP蛋白发挥催化活性，使得黄色底物TMB转化为蓝色产物。

RCH原理dCas9.jpg

产品描述：

来自 S. pyogenes 的 Cas9 核酸酶是依赖于 RNA 介导的内切核酸酶，可以特异地切割双链 DNA（在 DNA PAM 存在的情况下，也可以切割单链 DNA 或单链 RNA）。Cas9 切割位点位于目标序列（target sequence）内，离 PAM（NGG）区 3 个碱基。PAM 对于 Cas9 的识别和切割都是必需的。因为反应需要添加 RNA（sgRNA 或者 crRNA:tracrRNA），整个体系，包括 Cas9 酶都不能含有任何 RNase 活性。其中，Cas9 中的 HNH 和 RuvC 结构域分别负责切割靶标 DNA 中与 sgRNA 配对和非配对的链。在本产品中，Cas9 的 H840 和 D10 都被突变为 A，使 Cas9 的 HNH 和 RuvC 结构域均失活，获得 dCas9 蛋白。因此，dCas9 只有结合靶标 DNA 的活性，而没有切割靶标 DNA 的活性。

dCas9	100 pmol (1 pmol/μL)	1000 pmol (10 pmol/μL)
10× Buffer 3	1 mL	1 mL× 2

推荐反应体系（20 μL）：

组分	体积
10×Buffer 3	2 µL
250 nM sgRNA	2 µL
1 pmol/µL dCas9	1 µL
30 nM substrate DNA	2 µL
Nuclease-free water up to
37 °C培养30 min至1 h，然后通过非变性核酸电泳等方法对实验结果进行检测

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 产品仅供科研使用，不用于临床诊断。

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